毛细管电泳法筛选人IgG的Fc片段核酸适配体
杨歌 ，韩诗邈 ， 赵丽萍， 朱超 ，黄渊余 ，屈锋
基于毛细管电泳-指数富集配体系统进化技术（CE-SELEX）建立了免疫球蛋白G（IgG）的Fc片段的核酸适配体筛选方法。通过毛细管区带电泳方法分析IgG完整蛋白、Fc与Fab片段的样品的纯度、荷电性质及是否吸附的特征，并比较三者与核酸库的亲和力。结果表明，IgG与核酸库形成明显的复合物，而Fc和Fab片段与核酸库的亲和力很弱。在筛选Fc片段的适配体时，选择Fab片段作为反筛靶，对去除非特异性结合序列无显著作用。设计了针对Fc片段的适配体筛选方案，在优化的孵育条件（10 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4 （pH 7.17），0.05 mmol/L Mg2+，37℃孵育25 min）下，经3轮筛选获得Fc片段的核酸适配体Seq Fc1-3，KD值为0.071-0.321 μmol/L，经胶体金比色分析方法验证了其亲和力与特异性。
引言
免疫球蛋白（Immunoglobulin, Ig）是免疫系统在抗原刺激下，由效应B细胞分泌的可与相应抗原发生特异性结合的蛋白质。免疫球蛋白由两个不同的功能单元Fab和Fc片段组成。其中，Fab片段中包含了3个可变的互补决定区，用于结合特定的抗原表位；Fc片段能以多种方式参与免疫系统的调控[1]，可结合带有Fc受体（FcγR）的免疫细胞，通过抗原呈递细胞将抗原呈递给自适应免疫系统的效应细胞，发挥清除作用[2,3]。另外，Fc片段是许多蛋白质的靶标，可作为衔接分子的配体发挥调控功能。Fc片段与相关效应分子的相互作用是免疫球蛋白功能实现的关键。
多种免疫球蛋白（Ig A、Ig D、Ig E、Ig G、Ig M）均具有不同的生物分布与功能，在特定的触发条件下发挥独特的效应机制。IgG是最常用的免疫球蛋白，在大多数抗体反应中都涉及IgG介导的效应功能。Ig G在基于抗体的疗法中表现出良好的安全性，已成为治疗传染病的首选治疗性抗体[3]。研究表明,可通过操纵Ig G、Fc与Fc受体之间的相互作用改善Ig G效应功能[4]，如诱变靶向Ig G Fc核心或受体相互作用位点附近的氨基酸残基以及Fc片段的糖基化等[5~7]。筛选Fc片段的特异性识别配体，可提供潜在的Ig G Fc片段与其受体之间相互作用调节因子，而控制Ig G效应功能。核酸适配体是通过体外筛选获得的与目标分子有高亲和力与特异性的寡核苷酸序列，可作为化学配体参与分子间相互作用调控，并可通过pH、光敏等方式形成可逆的调控开关[8,9]。目前，已有免疫球蛋白Ig M、Ig E与Ig G的核酸适配体报道。Zumrut等[10]通过“配体引导选择”方法（LIGS），经13轮筛选获得膜结合Ig M（mIg M）的DNA适，可特异性结合B细胞淋巴瘤上的mIg M，用于癌症相关的生物标志物检测[11]。Bowser[12]通过CE-SELEX方法经4轮筛选获得了人Ig E的DNA适配体。Miyakawa等[13]通过Ni-NTA亲和树脂层析柱，经10轮筛选获得人Ig G的RNA适配体，用于人Ig G纯化。上述适配体筛选均使用了抗体整体蛋白，由于Fc片段在免疫过程中也发挥特定的功能，因此，针对抗体的Fc片段筛选适配体也很有意义。本研究基于CE-SELEX建立了免疫球蛋白Ig G的Fc片段的核酸适配体筛选方法。首先通过毛细管电泳方法评价Ig G及其功能片段样品的质量以及它们与核酸库的亲和力。在此基础上,设计了Fc片段的筛选策略、优化了筛选条件，并筛选获得了Fc片段的核酸适配体。Fc片段的适配体有可能做为人Ig G的潜在的效应功能调控因子。2
结果与讨论
Ig G、Fc和Fab的CZE分析
图1 (A) Ig G、(B) Fc和(C) Fab片段的CZE分析3.3 Ig G、Fc和 Fab与不同长度ssDNA库的结合分析
图2 Ig G、Fc、Fab片段与ssDNAN40相互作用
图3 Ig G、Fc片段、Fab片段与ssDNAN29(A)及ssDNAN15（B）的相互作用
Fc片段的适配体筛选
图4 Fc片段的适配体筛选：(A) 优化孵育条件下Fc与Fab与核酸库的相互作用,a～e分别为0.2 μmol/L ssDNAN40、加入Fab 5、10 μmol/L，加入Fc 5、10 μmol/L；(B)第一轮筛选（Round 1）复合物收集与次级库凝胶电泳图；(C) 第二轮筛选（Round 2）复合物收集；(D) 第三轮筛选（Round 3）复合物收集；(E) Fc片段与四轮次级库（R1、R2、R3和R4）的KD值
图5 序列的解离常数KD及二级结构
结论
本研究基于CE-SELEX建立了免疫球蛋白Ig G Fc片段的DNA适配体筛选方法，通过对Ig G完整蛋白、Fab片段与Fc片段与核酸库的亲和力表征，设计针对Fc片段的适配体筛选策略。结果表明，Ig G可与核酸库形成明显的复合物，而Fc片段和Fab片段与核酸库的亲和力很弱。在Fc片段适配体筛选过程中，选择Fab片段作为反筛靶，对去除Fc片段的非特异性结合序列无显著作用。在优化条件下，经3轮筛选直接获得Fc片段的特异性核酸适配体。此适配体有望用于Ig G的效应功能调控。本研究建立的筛选策略与条件，可为免疫球蛋白及其功能片段的适配体筛选提供参考。
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封面文章原文链接：http://www.analchem.cn/article/doi/10.19756/j.issn.0253-3820.191761
作者简介
屈锋 教授 北京理工大学生命学院教授，博士生导师
北京核酸适配体交叉技术学会理事长，北京色谱学会副理事长，中国色谱学会理事，《Electrophoresis》,《Chin Chem Let》，《色谱》编委。长期从事生物医学分析和毛细管电泳新技术新方法研究。专注基于毛细管电泳技术研究核酸适配体高效筛选机理和应用研究十余年，立足于解决核酸适配体高效筛选的瓶颈问题和建立适配体高效筛选平台，并取良好进展，所建立的方法具有普适性和实用意义，目前已筛选十余种重要功能蛋白的适配体。发表相关论文100余篇，授权中国发明专利六项。2019年在国际顶级期刊Biotechnology Advances发表综述Evolution of multi-functional capillary electrophoresis for high-efficiency selection of aptamers，2020《分析化学》第5期《核酸适配体筛选与分析应用》发表系列论文7篇。出版《生物分析中的核酸适配体》和《核酸适配体手册》译著，2012-2019《毛细管电泳年度回顾》专栏作者，讲授仪器信息网《神奇的毛细管电泳》系列网络课程。研究方向（1）基于毛细管电泳技术的核酸适配体筛选机理及应用研究；（2）毛细管电泳的生物医学分析新技术新方法研究；（3）毛细管电泳质谱联用技术及装置研究。
杨歌 博士后
2019年于北京理工大学生命学院获得博士学位，现为生命学院和前沿交叉学院博士后。在Biotechnology Advances、Nanoscale、分析化学等杂志以第一作者发表SCI论文5篇。申请中国发明专利1项。研究方向为毛细管电泳分析和核酸适配体筛选机理及应用。